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ANNO 2020

MAIS

A seguito della raccolta del mais per l'anno 2020, sono state inizialmente svolte le analisi presentate in Tabella 1. Più precisamente, è stato valutato l'impatto dei due fattori impiegati (tipo di trattamento e fertilizzazione azotata) sulla resa in granella e in biomassa, sull'assorbimento di azoto sia nella granella che nella biomassa e sull'efficienza dell'uso dell'azoto (NUpE). 

Tabella 1. Analisi della varianza dell'impatto del trattamento e della fertilizzazione azotata sulla resa in granella, N-uptake della granella, biomassa, N-uptake della biomassa, efficienza dell'uso dell'azoto (NUpE). 

La resa in granella e l'assorbimento di N nella granella non sono stati influenzati dai fattori o dall'interazione tra i fattori (Tabella 1). Al contrario, la biomassa e l'assorbimento di N nella biomassa sono stati significativamente influenzati dalla fertilizzazione N, con la fertilizzazione N al 100% con valori superiori al 70% di fertilizzazione N per entrambi i parametri. La NUpE è stata significativamente influenzata dalla fertilizzazione azotata e dall'interazione del trattamento del mais (T) × N. Complessivamente, la fertilizzazione con N al 70% ha avuto una NUpE maggiore rispetto alla fertilizzazione con N al 100%. 

L'assenza di differenze significative nelle rese è molto probabilmente imputabile al fatto che i terreni utilizzati avevano una buona dotazione di azoto, quale risultato di pregresse attività di fertilizzazione. Ciò nonostante, poiché è stata evidenziata una tendenza del biostimolante a supportare le rese (soprattutto in basso N), sono state calcolate le efficienze d'uso dell'azoto (metodo Dumas dell'azoto) (Figura 1).

Figura 1. Efficienza d'uso dell'azoto (NUpE) a seguito di trattamenti con i biostimolanti (T2 e T3 per sistema integrato e batteri rizosferici, rispettivamente), rispetto al controllo (T1), in condizioni di apporto del 70% e del 100% dell'azoto richiesto.

Pertanto, avendo evidenziato una miglior efficienza d'uso dell'azoto (che era il target principale nelle prove mais, avendo una coltura che ha una elevata richiesta di azoto a fronte di una moderata efficienza d'uso di questo nutriente), sono state condotte prove ulteriori in metabolomica e di morfologia sulle radici, per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base dell'incremento in NUpE osservato. L'analisi di metabolomica è stata condotta in cromatografia liquida UHPLC accoppiata a spettrometria di massa untargeted (UHPLC-ESI/QTOF-MS), associata a statistica multivariata (hierarchical clustering, OPLS-DA) e seguita da interpretazione con pathway analysis (Figure 2, 3 & 4). Le prove di morfologia radicale sono state condotte con scanner radicale WinRhizo, e sono state seguite dal calcolo del peso secco radicale (RDW) (Tabella 2).

Tabella 2. Distribuzione per sezioni di diametro delle radici, prova parcellare mais, azienda CERZOO.

Nel complesso, la metabolomica untargeted UHPLC/QTOF ha permesso di annotare 3830 composti putativi nelle radici di mais. Inizialmente, il fold change-based unsupervised hierarchical cluster analysis (HCA) è stato effettuato per descrivere le somiglianze e le dissimilarità tra i trattamenti, sulla base di profili metabolici. La prima analisi, effettuata considerando anche il regime di fertilizzazione, ha mostrato che il trattamento microbico ha fornito un effetto gerarchicamente più forte sul metaboloma della radice di mais, con repliche relative al regime di fertilizzazione non discriminate all'interno di ogni trattamento.

Pertanto, il livello di concimazione non è stato considerato come fattore di clusterizzazione nel seguente clustering, per evidenziare specificamente le differenze relative ai trattamenti di semi (Figura 2). Quest'ultima analisi ha evidenziato due cluster principali, che hanno separato i campioni di radici di mais non trattati da quelli trattati, anche se il T2 ha mostrato una firma fitochimica distintiva rispetto al T3.

Figura 2. Cluster gerarchico del profilo metabolico di radici di mais, prova parcellare mais, azienda CERZOO.

Successivamente, al fine di indagare il contributo dei diversi metaboliti per la discriminazione del trattamento, è stata eseguita una proiezione ortogonale supervisionata dell'analisi discriminante delle strutture latenti (OPLS-DA). Il grafico del punteggio OPLS-DA (Figura 12) ha mostrato una chiara differenziazione tra i tre trattamenti, con bontà di correlazione (R2Y = 0.981), bontà di previsione (Q2Y = 0.424), adeguati parametri di convalida incrociata (CV-ANOVA p = 0.035) e senza overfitting come fornito tramite test di permutazione (N = 100). In seguito, l'importanza delle variabili in proiezione (VIP) è stata utilizzata per selezionare i composti che avevano il più alto potenziale di discriminazione (punteggio VIP > 1.3) nel modello di predizione. L'approccio VIP ha permesso di identificare 323 composti in cui sono inclusi una larga diversità di metaboliti, tra cui principalmente aminoacidi, lipidi, flavoni, fenilpropanoidi lignani e fito-ormoni.

Figura 3. Analisi discriminante OPLS-DA del profilo metabolico di radici di mais, prova parcellare mais, azienda CERZOO.

La pathway analysis costruita a partire dai metaboliti responsabili delle differenze osservate (i cosiddetti markers discriminanti), ha evidenziato un forte coinvolgimento del metabolismo secondario, in particolare di fenilpropanoidi, metaboliti azotati e terpeni.

Figura 4. Interpretazione biochimica (pathway analysis) dei metaboliti discriminanti in radici di mais trattate con biostimolanti, prova parcellare mais, azienda CERZOO.

In parallelo, è stata analizzata la diversità microbica nelle rizosfere delle radici di mais, utilizzando un approccio non-target di sequenziamento DNA relativo alle regioni ipervariabili V3 e V4 del 16S rRNA (DNeasy PowerSoil Kit, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) (Figura 5).

Figura 5. Analisi della diversità microbica nella rizosfera di radici di mais trattate con biostimolanti, prova parcellare mais, azienda CERZOO.

La diversità della comunità batterica nei campioni di rizosfera è stata analizzata come α- e β-diversità, rispettivamente dal numero totale di specie osservate (Sobs), indici Chao e Simpson e uniformità di Shannon, e dal confronto tassonomico di tutti i campioni. Sebbene fossero presenti tendenze e differenze suggestive, la distinzione complessiva dell'impatto dei trattamenti dal punto di vista dell'α-diversità non era così chiara come nel caso dell'analisi metabolomica delle radici del presente lavoro. L'indice di uniformità di Shannon ha indicato una leggera diminuzione della biodiversità per i trattamenti T2 e T3, con quest'ultimo inferiore al controllo e T2. L'impatto dei livelli di fertilizzazione ridotti, 70% vs 100%, è rimasto insignificante tra i trattamenti. In sostanza, l'effetto del biostimolante è risultato più evidente, quello dell'interazione biostimolante-livello azotato meno.

Tutti i risultati ottenuti da questo esperimento sono stati pubblicati sulla rivista Physiologia Plantarum al seguente link: 10.1111/ppl.13679.